畜牧兽医学报 ›› 2016, Vol. 47 ›› Issue (9): 1806-1816.doi: 10.11843/j.issn.0366-6964.2016.09.008
王苗,罗军 * ,许会芬,朱江江,赫秋亚,姚大为,史怀平
WANG Miao,LUO Jun*,XU Hui-fen,ZHU Jiang-jiang,HE Qiu-ya,YAO Da-wei,SHI Huai-ping
摘要:
本研究旨在通过构建西农萨能奶山羊胰岛素诱导基因1 (INSIG1) 的重组腺病毒(Adenovirus,Ad) 超表达载体,研究该基因超表达后对乳腺上皮细胞中脂质合成的影响,从而为该基因在山羊乳腺脂质合成调控中的功能研究奠定基础。根据GenBank (登录号:JQ665439)中山羊INSIG1基因序列设计引物,PCR扩增得到其CDS区序列。将目的基因连接到穿梭载体pAdTrack-CMV后获得pAdTrack-CMV-INSIG1质粒,将该质粒Pme Ⅰ线性化后转入大肠杆菌BJ5183感受态细胞进行同源重组,获得pAdEasy-INSIG1重组腺病毒超表达载体。该重组质粒经Pac Ⅰ线性化后转染293A细胞进行病毒的包装及扩繁,利用LaSRT法测定其滴度。将获得的重组腺病毒Ad-INSIG1感染山羊原代乳腺上皮细胞,利用实时荧光定量PCR检测INSIG1及脂质合成相关基因的mRNA表达情况,利用GPO-Trinder酶学反应检测细胞中甘油三酯的含量。结果表明,成功构建了奶山羊INSIG1基因重组腺病毒超表达载体,获得了具有较高滴度 (2×108 U•mL-1) 的超表达腺病毒Ad-INSIG1;Ad-INSIG1感染山羊原代乳腺上皮细胞48 h后,与Ad-GFP组相比,INSIG1基因的mRNA表达量上调约500倍,固醇调节元件结合蛋白1 (SREBP1)和SREBP裂解活化蛋白 (SCAP) 的mRNA表达量无明显变化,参与脂肪酸从头合成 (ACCα、FASN) 及去饱和 (SCD1) 基因的mRNA表达量均显著下降 (P<0.05);参与甘油三酯合成的3个关键基因中,GPAM及DGAT2的mRNA表达量显著下降 (P<0.05),AGPAT6的表达无显著变化;同时,催化甘油三酯分解 (ATGL)的基因mRNA表达量也显著下降 (P<0.05);细胞内甘油三酯含量无显著变化。综上所述,在山羊原代乳腺上皮细胞中,INSIG1能够抑制脂质合成相关基因的表达,对山羊乳腺脂质合成具有调控作用。
中图分类号: